Cell Death Dis︱袁凌青团队揭示血管钙化新作用机制：血管壁微环境中内皮细胞分泌的外泌体调控尿毒症动脉中膜钙化
撰文︱单素康
责编︱方以一，王思珍
编辑︱方以一
心血管疾病是人类健康的隐形杀手，2016年中国心血管病报告显示心血管病死亡率居于首位，远高于肿瘤及其他疾病。目前，一种严重的血管病变——血管钙化（vascular calcification）吸引了许多研究人员关注，流行病学调查发现，我国60岁以上人群中70%以上都有不同程度的主动脉钙化[1]。在终末期肾病患者中，血管钙化与患者心血管事件、全因死亡率、截肢呈正相关[2]。荟萃分析提示既往的他汀类、阿司匹林类药物治疗对血管钙化无效[3-5]，而发生了钙化的血管手术难度大，疗效和预后差[6]，因此血管钙化成为心血管研究领域的研究热点和难点，深入探寻其发病机制，寻找潜在的干预靶点，具有重大的现实意义。
动脉钙化的主要特征是羟磷灰石在血管壁上的积聚，而血管壁微环境中具有多种功能活跃的调节细胞，如内皮细胞（endothelial cells，EC），巨噬细胞，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）等[7]。VSMC向成骨细胞样细胞的转分化被认为是动脉钙化的关键病理过程[8]。研究表明EC在动脉粥样硬化中发挥了重要的作用[9]，EC受损有利于脂质沉积，是一系列病理损害的始动因素。EC也可以通过分泌多种血管收缩/舒张因子调控血管生态，近期研究发现EC及其前体细胞可通过分泌外泌体的方式广泛影响包括心肌肥厚、心肌梗死在内的多种心血管疾病[10,11]，然而血管内皮细胞是否参与动脉中膜钙化调控以及通过何种机制尚不清楚。
2022年7月26日，国家代谢性疾病研究中心、中南大学湘雅二医院代谢内分泌科袁凌青教授在Cell Death Dis上在线发表题名为“The crosstalk between endothelial cells and vascular smooth muscle cells aggravates high phosphorus-induced arterial calcification”的研究文章。该研究发现在高磷环境下，血管内膜EC细胞携带并转运富含miR-670-3p的外泌体，通过旁分泌的方式传递至中膜VSMC，促进中膜VSMC成骨分化和矿化结节沉积。该发现揭示了血管壁细胞间的“对话”，为构建血管壁微环境学说提供了坚实的依据，对深入认识尿毒症高磷条件下动脉中膜钙化的发病机制及潜在的治疗靶点提供了重要的参考价值。
图1 HPi-EC Exo中miR-670-3p 参与血管平滑肌细胞钙化的作用机制示意图
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
研究者分别提取了正常磷诱导内皮细胞分泌的外泌体（NPi-EC Exo）和高磷诱导内皮细胞分泌的外泌体（HPi EC Exo）（图2 A-C），将外泌体用荧光染料PKH26标记，通过将标记好的外泌体与VSMC共孵育，孵育完成后用α-SMA复染显示血管平滑肌的肌丝，并用DAPI标记细胞核以完整地显示VSMC的细胞形态。于激光共聚焦显微镜下可以观察到，绿色荧光标记的VSMC边界清晰，呈梭型，符合VSMC的典型形态，而红色荧光标记的外泌体均匀地分布在细胞核的周围，成功被摄入到VSMC中（图2 D）。
图2 EC-Exo的鉴定
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
接着，研究者用外泌体干预VSMC细胞，发现HPi-EC Exo相比于NPi-EC Exo可明显促进茜素红染色阳性矿化结节增加，同时成骨分化指标Runx2 、ALP 表达上调（图3 E-G），VSMC钙化增加。此外，研究者通过transwell小室构建了EC与VSMC共培养体系，模拟体内血管，从侧面证实了内皮细胞在VSMC成骨分化中扮演着重要的角色（图3 H-I）。
图3 HPi-EC Exo促进VSMC矿化结节形成
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
在机制研究方面，研究者首先通过microarray芯片分析了NPi-Exo和HPi-Exo中差异表达的microRNAs（图4A）。接下来通过酶消化证实了miR-670-3p是来源于外泌体而非游离上清（图4 B, C），qRT-PCR验证了miR-670-3p是HPi-Exo中主要富集的效应分子（图4 D, E）。此外，研究者通过追踪带有FAM荧光基团的miR-670-3p的模拟片段（miR-670-3p mimics），证实了miR-670-3p通过外泌体向VSMC的转运过程（图4F）。
图4 芯片分析HPi-EC Exo运载的miRNAs
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
之后，研究者敲减和过表达外泌体中miR-670-3p进行了功能实验，发现过表达EC外泌体中miR-670-3p使得VSMC钙化增强，而敲减EC外泌体中miR-670-3p使得VSMC钙化效应指标表达减弱（图5G-I）。
图5 miR-670-3p是EC-Exo中促进VSMC钙化的效应分子
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
接下来，研究者采用预测软件并对miR-670-3p下游靶基因进行了预测，通过荧光素酶报告基因，证实了IGF-1 是miR-670-3p直接结合的靶基因。通过构建IGF-1过表达质粒，与miR-670-3p mimics进行共转染，进行功能回复实验。发现miR-670-3p的促钙化作用可以被过表达IGF-1所逆转，上述结果证实miR-670-3p是通过下调IGF-1发挥钙化调节作用的。同样地，作者通过活体成像技术和免疫荧光技术发现EC-Exo在体内可以被血管组织摄取（图6 B, C）。
图6 HPi-EC Exo外泌体在小鼠体内摄取情况
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
接下来研究者通过条件性基因敲除技术构建内皮细胞特异性miR-670-3p敲除和敲入小鼠，发现敲入miR-670-3p将进一步加剧尿毒症小鼠的动脉钙化（图7 E, G）， 敲除miR-670-3p则可以减轻尿毒症小鼠的动脉钙化（图7 F,H）。
图7 miR-670-3p调控尿毒症小鼠动脉中膜钙化
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
最后，研究者在临床血浆标本中验证了miR-670-3p与IGF-1在终末期肾病患者以及性别-年龄匹配健康对照者中的表达差异（图8 A, B），并发现miR-670-3p与IGF-1呈负相关（8C）。通过对终末期肾病的患者进行钙化评分，发现miR-670-3p与钙化评分呈正相关（图8E），而IGF-1与钙化评分呈负相关（图8F）。
图8 ESRD 患者循环外泌体中升高的miR-670-3p与降低的 IGF-1 相关
（图源：Lin, X. et al. Cell death & disease, 2022）
综上所述，该研究聚焦于血管壁微环境，揭示了外泌体介导的皮内细胞（EC）源性非编码微小RNA对动脉中膜血管平滑肌细胞（VSMC）的调控，并通过构建条件性敲除小鼠以及采集临床样本进行强有力地验证，对进一步理解血管钙化的病理机制、指导临床治疗提供了崭新的契机。外泌体这一新兴媒介将推动血管钙化的研究由单细胞向多细胞、多器官甚至多系统发展。除此之外，外泌体是表现优异的诊断标志物，并具备广阔的治疗前景，当然这需要更多的研究工作支持。值得注意的是,除了微小RNA，外泌体中还包裹了大量的脂质、蛋白、mRNA、lncRNA等，因此，外泌体分泌增加的上游调控因素，包裹运输的其他效应分子，IGF-1的受体前及受体后水平以及其他调控因子的互相作用，还有待进一步研究。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35882857/
通讯作者：袁凌青（左三），第一作者：林潇（左二）、 单素康（右二）
（照片提供自：袁凌青实验室）
通讯作者简介：（上下滑动阅读）
袁凌青，博士生导师，教授，主任医师，中南大学湘雅二医院特聘研究员，中南大学湘雅二医院代谢内分泌科副主任。中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会常务委员兼秘书、中华医学会内分泌分会青年委员，《中华内分泌代谢杂志》编委。从事内分泌临床工作20年，积累了大量的临床经验，擅长骨质疏松、甲状腺疾病、肾上腺疾病、糖尿病及疑难内分泌疾病的诊疗。先后主持国家自然科学基金4项，及教育部新世纪优秀人才、湖南省重点研发计划等省部级课题10余项。入选香港学者协会遴选的“香江学者”，获得2008年国家科技进步奖二等奖，第一作者或通讯作者发表SCI论文58篇，担任《Bone》杂志编委，《Frontiers in Endocrinlogy》、《International Journal of Endocrinology》和《Biomed Research International》客座主编。
【1】Cell Death Dis︱杨锦建/贾占奎团队新研究证实AOC1有望成为前列腺癌治疗的新靶点
【2】Front Immunol︱姜春来/张勇团队发现肌内接种AS02佐剂呼吸道合胞病毒亚单位疫苗展现出更好的免疫效果和安全性
【3】Nat Commun︱程亦凡团队运用融合蛋白策略和冷冻电镜技术成功解析G蛋白偶联受体非激活构象
【4】Cell Death Differ︱秦仁义团队发现去泛素化酶USP14有望成为治疗胰腺癌的新靶点
【5】Nat Methods︱王涛/王莉团队合作开发空间转录组数据降噪的新方法
【6】Sci Adv︱巫林平/孙家明/陈国强团队制备有机水凝胶解决小直径血管移植物修复缺损问题
【7】小鼠云课堂︱Omentin-1基因敲除小鼠与慢性炎症性疾病
【8】eClinicalMedicine︱荟萃分析：重复经颅磁刺激对帕金森病的疗效
参考文献（上下滑动阅读）
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本文完